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維生素B1(Vitamin B1,VB1)試劑盒說明書
更新時(shí)間:2020-03-06 點(diǎn)擊量:2616

維生素B1(Vitamin B1,VB1)試劑盒說明書

分光光度法

50管/48樣 注意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。 測定意義 維生素B1(Vitamin B1)是構(gòu)成脫羧輔酶的主要成分,參與細(xì)胞代謝中的三羧酸循環(huán),是維持機(jī)體正常代謝必須的水溶性維生素,在生物體能量代謝中有重要的作用。 測定原理 VB1在堿性條件下還原。。。。。。。。。與Fe3+在弱酸條件下生成普魯士藍(lán),在704nm有特征吸收峰。 自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器 天平、研缽、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、1 mL玻璃比色皿、蒸餾水。 試劑組成和配制 提取液:液體35mL×1瓶,4℃保存。 試劑一:液體1mL×1瓶,4℃保存。 試劑二:液體5mL×1瓶,4℃保存。 試劑三:液體5mL×1瓶,4℃避光保存。 試劑四:液體12mL×1瓶,4℃保存。 試劑五:液體6mL×1瓶,4℃避光保存。 樣本處理
1. 組織:將樣品磨碎,按照質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g,加入0.6mL提取液)加入提取液,60℃浸提30min,加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,13000g離心10min,取上清測定(動物組織等蛋白含量較高的樣本建議離心20-30分鐘)。
2. 細(xì)胞:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500萬細(xì)胞加入0.6mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);加蒸餾水0.4mL,混勻后于25℃,13000g離心10min,取上清測定。
3. 血清:直接測定。
測定操作
空白管
測定管
樣品(μL)
0.1
試劑一(μL)
100
試劑二(μL)
80
80
試劑三(μL)
100
100
充分混勻,80℃反應(yīng)10min
提取液(μL)
80
80
試劑四(μL)
220
220
試劑五(μL)
120
120
H2O(μL)
300
300
充分混勻,靜置20min,于1mL玻璃比色皿,蒸餾水調(diào)零,測定704nm處吸光值,記為A空白管和A測定管,△A=A測定管-A空白管。
計(jì)算公式 標(biāo)準(zhǔn)曲線:y = 0.1902x - 0.1833,R2 = 0.9991 1. 按照蛋白含量計(jì)算
VB1含量(μg/mg prot)=(△A +0.1833)÷ 0.1902×V反總÷(V樣×Cpr) = 52.58×(△A +0.1833)÷ Cpr 2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算 VB1含量(μg/g)=(△A +0.1833)÷ 0.1902×V反總÷(V樣×W÷V樣總) = 52.58×(△A +0.1833)÷ W 3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算 VB1含量(μg/104 cell)=(△A +0.1833)÷ 0.1902×V反總÷(V樣×細(xì)胞數(shù)量÷V樣總) = 52.58×(△A +0.1833)÷ 細(xì)胞數(shù)量 4. 按照液體體積計(jì)算 VB1含量(μg/mL)=(△A +0.1833)÷ 0.1902×V反總÷V樣 = 52.58×(△A +0.1833) V反總:反應(yīng)總體積,1mL;:V樣:加入樣本體積,0.1mL;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:蛋白濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g 注意事項(xiàng)
1. 若測定結(jié)果中吸光值超過1,請將樣本稀釋后進(jìn)行測定,并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2. 蛋白濃度較高的樣品,比如動物組織,若顯色完成后有沉淀產(chǎn)生,將樣本稀釋后再測定,在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
3. 顯色完成后立即進(jìn)行測定。

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